小麦茎さび病抵抗性遺伝子 Sr43 は珍しいプロテインキナーゼをコードする

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害虫や病気からパン小麦を守るために、育種家は 200 を超える耐性遺伝子をそのゲノムに導入し、小麦遺伝子プール内の指定耐性遺伝子の数をほぼ 2 倍にしました 1。これらの遺伝子を単離すると、育種プログラムでの迅速な追跡と、より耐久性のある耐性を得るためにポリジーンスタックへの組み込みが容易になります。私たちは、野草 Thinopyrum elongatum からパンコムギと交配した茎さび病抵抗性遺伝子 Sr43 をクローニングしました2,3。 Sr43 は、機能が未知の 2 つのドメインに融合した活性プロテインキナーゼをコードします。この遺伝子はトリティス科に特有のもので、670万年から1160万年前の遺伝子融合現象を通じて生じたと考えられる。コムギにおける Sr43 のトランスジェニック発現は、茎さび病を引き起こす病原体の広範囲の分離株に対する高レベルの耐性を与え、耐性育種および工学における Sr43 の潜在的な価値を強調しています。

世界中で、パン用コムギ (Triticum aestivum) の予測生産量の約 20% が毎年害虫や病気によって失われています4。病気耐性のための遺伝的変異の導入は、小麦作物を保護するための持続可能で環境に優しい方法です5。 100年以上にわたり、育種家はコムギの遺伝子プールに耐性遺伝子を豊富にするために数多くの交配を行ってきました。注目すべきことに、栽培パンコムギで現在指定されている耐性遺伝子 467 個のうち 200 以上がパンコムギの遺伝子プールの外に起源を持っています1。しかし、これらの種間耐性遺伝子の展開は、連鎖ドラッグ、つまり連鎖遺伝子からの有害な対立遺伝子の同時導入によって妨げられることがよくあります。さらに、単一の耐性遺伝子は、耐性を破壊する病原体株の出現によって急速に克服される傾向があります6。個々の耐性遺伝子をクローニングすると、それらを遺伝子組み換えポリジーンスタックとして導入できるようになり、より耐久性の高い耐性が得られる可能性があります7。

これまでにクローニングされた約 291 個の植物病害抵抗性遺伝子のほとんどは、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピート (NLR) クラスの細胞内受容体、または細胞外膜アンカー受容体様タンパク質 (RLP、細胞内キナーゼを含む場合は RLK と呼ばれます) のいずれかをコードしています。）（補足表1）1、8。最近、耐性遺伝子の新しいグループが明らかになりました。そのメンバーは、1 つのタンパク質として融合された 2 つのプロテインキナーゼをコードしています。これらのタンデムキナーゼ遺伝子には、Rpg1、Yr15、Sr60、Sr62、Pm24、WTK4、およびRwt4が含まれます（参考文献9、10、11、12、13、14、15）。他の耐性遺伝子は、ステロイド生成性急性調節タンパク質関連脂質転移ドメイン (Yr36)16、C2 ドメインおよび多貫通領域 (Pm4)17、主要な精子タンパク質 (Snn3)18 に融合したプロテインキナーゼにより、この構造に何らかのバリエーションを提供します。 NLR (Tsn1、Rpg5、および Sm1)19、20、21、およびフォンヴィレブランド因子 A 型ドメイン (Lr9)22。

これらのキナーゼ融合タンパク質をコードする耐性遺伝子は、1,200万年前に発生し、穀類の小麦、ライ麦 (Secale cereale) および大麦 (Hordeum vulgare) を含むイネ科のクレードであるトリチセ科 (Triticeae) に特有であると考えられます。しかし、これらの遺伝子を生じさせる融合事象は、稀で孤立しているどころか、異なるクラスのキナーゼ間で何度も起こり、多様な組み合わせが生み出されました 10,12。このゲノムの革新により、約 3 億年前の子嚢菌と担子菌の分裂にまたがる系統発生的に異なる真菌病原体に対する耐性がもたらされました。

ここでは、45 年前に背の高いウィートグラス (Thinopyrum elongatum) からパン小麦に導入された茎さび病抵抗性遺伝子 Sr43 をクローニングしました 2,3。優性耐性遺伝子 Sr43 は、六倍体コムギの染色体 7D に遺伝子移入されました (図 1a、b)。我々は、Sr43遺伝子移入系統の穀粒をメタンスルホン酸エチル（EMS）で突然変異誘発し、2,244の生き残ったM2家族をPuccinia graminis fに対する感受性についてスクリーニングした。 sp. トリチ（Pgt）。茎さび病感受性について分離している23の家族を特定し、そのうち子孫検査（補足表2）および遺伝子型決定（補足図1〜11）によって10の独立した変異体を確認しました。

あ、こ。 elongatum 染色体 7. b、コムギ-Thinopyrum 転座染色体の概略図。 c, 予測された Sr43 遺伝子モデルに沿って特定された EMS 変異。 d、EMS変異によって誘発される予測ドメインおよびアミノ酸変化を示すSr43の概略図。 e、AlphaFold によって予測された Sr43 の三次元モデル。緑色、キナーゼ。オレンジと青、DUF ドメイン。黄色の柔軟なリンカー。 f、小分子ドッキングプログラムHADDOCK28によって決定された、ATP分子に結合したDUF668内の高信頼ATP結合部位（赤色残基）の構造詳細（eの破線ボックス）。 ATP は、水素結合 (赤色の線) によって DUF668 残基に接続された棒構造 (薄緑色) として示されています。

Sr43 をクローン化するために、染色体フローソーティングを実行し、小麦-Th の配列を決定しました。 elongatum 親株の組換え染色体 7D および 8 つの変異体 (拡張データ図 1 および補足表 3 および 4)。親株の配列アセンブリと変異リードのマッピングにより、8 つの変異すべてに変異を含む足場内の 10 キロベース (kb) ウィンドウが特定されました。 Sr43 候補の遺伝子構造を決定するために、(1) Sr43 実生の葉のトランスクリプトームディープシーケンス (RNA-seq) 解析を実施し、リードを Sr43 ゲノム足場にマッピングしました (拡張データ図 2a)。(2) 配列決定された Sr43完全長の相補的 DNA ライブラリーからポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によって得られたクローン。 4 つの異なるスプライスバリアント (拡張データ図 2b および補足表 5 および 6) を検出しました。スプライスバリアント 1 には 8 つの変異すべてが含まれており、2,598 塩基対 (bp) の予測オープンリーディングフレームを持つ 18 個のエクソンで構成されていました (図 1c)。 8つの変異はすべてEMS変異誘発に典型的なG/CからA/Tへの移行であり、予測されたコード配列に非同義の変化（7つの変異体）または早期停止コドンが導入されました（図1c、dおよび補足表7および8）。。染色体 7D の 5,822 個の非重複遺伝子のうち、すべての変異体が偶然同じ遺伝子に変異を持つ確率 (参考文献 24) は 4 × 10-6 であり、同定された遺伝子が Sr43 の良い候補であることを示しています。。

同定されたすべてのEMS変異は主な完全長Sr43転写物に影響を及ぼしたため（図1c）、その予測された866アミノ酸配列を使用して機能ドメインとホモログを検索しました。我々は、Sr43がそのC末端にN末端キナーゼドメインと2つの機能不明ドメイン（DUF）を保有していることを決定しました（図1d）。変異のうち 5 つはキナーゼドメイン内に存在し、残りの 3 つの変異はいずれかの DUF に影響を及ぼしました（図 1d）。

Sr43キナーゼドメインの最も近いBLASTホモログは、セリン/スレオニンキナーゼインターロイキン-1受容体関連キナーゼ（STKc IRAK）であり（補足図12）、Sr43がおそらくキナーゼであることを示しています。さらなる相同性検索により、キナーゼドメインが無傷であることが示唆されました（補足図13）。この観察を裏付けるように、我々は、大腸菌から精製されたアフィニティータグ付きSr43融合タンパク質が、インビトロでマルトース結合タンパク質DNAジャイレースをリン酸化することを発見した（補足図14〜16および補足表9）。さらに、変異体1013aはグリシンに富むループ内の保存されたグリシン残基の1つを破壊し、Sr43の機能にはキナーゼ活性が必要であることを示唆しています（補足表10）。 DUF3475 と DUF668 を含む Sr43 の C 末端は、植物の成長に重要なシロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana) 由来のフィトスルフォカインシミュレーター (PSI) タンパク質の N 末端と類似したドメイン構造 (44% の同一性) を持っています 25。シロイヌナズナ PSI1 とは異なり、Sr43 には推定上の核局在化シグナルや推定上のミリストイル化部位が欠けていました。 InterPro が予測したように、Sr43 には膜貫通ドメインがありませんでした。しかし、我々は、ニコチアナ・ベンサミアナ葉表皮細胞におけるSr43-GFP（緑色蛍光タンパク質）構築物の一時的発現から検出される蛍光によって証明されるように、Sr43がおそらく核、細胞質、および色素体に局在していることを確立しました（拡張データ図3）。。 Sr43-GFPをトランスフェクトしたコムギプロトプラストでは、核および細胞質への局在が確認されました（拡張データ図3）。

したがって、Sr43のドメイン構造は、大部分（73％）が細胞外または細胞内免疫受容体であった約290のクローン化植物抵抗性遺伝子によってコードされるタンパク質の構造とは明らかに異なりました（補足表1）。 Sr43 の異常な構造をより詳細に調査するために、AlphaFold 人工知能拡張システムを使用して三次元 (3D) モデル 26 (補足データ 1) を生成しました。我々は、Sr43がキナーゼと2つのDUFが柔軟なリンカーループで分離されたモジュール構造を採用していることを決定しました（図1e）。キナーゼドメインにはαヘリックスと逆平行のβストランドが含まれていましたが、DUFは完全に⍺ヘリックスでした。私たちは、Sr43 タンパク質の予測構造を Protein Data Bank の構造と比較しました27。これにより、DUF668 とそのキナーゼドメインの外側のいくつかの受容体様プロテインキナーゼ様タンパク質との間の構造的類似性が特定されました。低分子ドッキングプログラムHADDOCK28を使用してATP結合部位を検索し、DUF668内の1つの高信頼性ATP結合部位を特定しました（図1f、補足表11および補足データ2）。

我々は、3.2 kbの上流および2.5 kbの下流調節配列を含む14 kbのゲノムSr43フラグメントをクローニングし（図2a）（補足表12）、得られたバイナリー構築物を小麦品種フィールダーに導入した。我々は1つの初代（T0）トランスジェニック植物を入手し、定量的PCR（qPCR）に基づいて、推定2コピーのSr43を持つ遺伝的に安定した系統を同定しました（補足表13〜14および補足図17）。ホモ接合型 T1 および T2 株を、北アメリカ、中東、ヨーロッパ、アフリカからの地理的および表現型が多様な 11 種類の Pgt 分離株のパネルに対してテストしました。 10のケースでは、Sr43トランスジェニックおよび野生型遺伝子移入系統は耐性でしたが、品種チャイニーズスプリング（遺伝子移入親）およびフィールダーは感受性でした（図2b、拡張データ図4a、b、および補足表15）。対照的に、Pgt 分離株 75ND717C は、Sr43 遺伝子移入およびトランスジェニック系統に対して中程度の毒性でした (図 2b)。 Pgt 分離株 69MN399 については、21 °C と 26 °C で表現型を比較し、以前の観察と一致して、高温で Sr43 媒介抵抗性が顕著に減少していることに気づきました 29 (図 2c)。総合すると、これらの結果は、(1) Sr43 の広範囲の有効性 (参考文献 29)、(2) 14 kb の Sr43 ゲノム断片が機能するには十分であること、および (3) トランスジェニック系統が人種特異的な遺伝子を忠実に再現していることを確認します。野生型 Sr43 の温度感受性耐性。

a、コムギ品種への形質転換に使用されるSr43ゲノム断片の概略図。野手。ｂ、Ｐ．グラミニスを接種した非トランスジェニック野生型フィールダーおよびヌル対照と並んで、Ｓｒ４３野生型およびトランスジェニック系統の実生からの代表的な葉。 sp. tritici は 14GEO189-1 (Sr43 に対して無毒性) および 75ND717C (Sr43 に対して中毒性) を分離します。 c、Pgt単離物69MN399に対するSr43媒介耐性に対する温度の影響。スケールバー、1cm。

私たちは、その進化的起源を調査するために Sr43 ホモログを検索しました。我々は、6,000万年の進化にわたるイネ科全体にわたって、キナーゼドメインまたは2つのDUFのみを保有するタンパク質を特定しました（補足表16および17および拡張データ図5および6）。 Sr43タンパク質ドメインの配置は、トリチセ科のThinopyrum属、Triticum属、Aegilops属、およびSecale属内でのみ検出され、Hordeum属内では検出されませんでした。これは、Sr43がおそらく670万年から1160万年前の間に発生したことを示唆しています（図3および補足表18）。明確な Sr43 ホモログを欠く系統では、Sr43 に存在するキナーゼおよび DUF をコードする遺伝子を、異なる染色体 (たとえば、ソルガムビカラー、ゼアメイズ、T. ウラルトゥ、および Ae. シャロネンシス) または同じ染色体 (ただし 6 ～ 36 番目) にマッピングしました。メガベース (Mb) 離れている (Ae. tauschii および Setaria italica) ことは、Sr43 遺伝子座における DUF へのキナーゼドメインの動員には異所性組換え事象が関与していることを示唆しています (補足表 18)。 Thinopyrum elongatum では、祖先の状態と Sr43 が種内多型として保持されていました。 Aegilops と Triticum の一部の種は祖先の状態を保持していましたが (Ae. tauschii など)、他の種は Sr43 の革新を保持していました (T. aestivum および T. durum B ゲノムなど) (図 3)。

数百万年における最後の共通祖先の年齢は、参考文献に基づいて各ノードに示されます。 23. コムギ科クレードは灰色で強調表示されています。種は下部に示され、次のように省略されます。Tel、Thinopyrum elongatum。アスプ、Ae。スペルトイデス。 TtB、Triticum turgidum ssp. デュラムBゲノム。 TdB、T. dicoccoides B ゲノム。 TaB、T. aestivum B ゲノム。 TtA、T. turgidum ssp. デュラムAゲノム。 TdA、T. dicoccoides A ゲノム。 TaA、T. aestivum A ゲノム。 Tu、T.雪。または、Aegilops bicornis。アセ、アエ。サーシー。あるいは、Aさん。ロンギッシマ。トネリコ、Aegilops sharonensis。で、Ae。タウスキー。 TaD、T. aestivum D ゲノム。 Sc、シリアルスケール。 Hv、Hordeum vulgare; として、サティバオーツ。 Bd、Brachypodium の分離。ああ、イネ。はい、セタリアイタリカです。 Sb、ソルガム二色。ズム、ゼアトウモロコシ。各種について分析されたゲノムの数は括弧内に示されています。

要約すると、我々は、2 つの DUF に融合したプロテインキナーゼをコードする小麦茎さび病抵抗性遺伝子 Sr43 をクローニングしました。これまでにクローン化された82個のコムギ科耐性遺伝子のうち、ほとんどがNLRをコードし(n = 46)、次にプロテインキナーゼ融合タンパク質(n = 15)がコード化されている(補足表19)。後者のうち、7 つはタンデムキナーゼですが、Sr43、Pm4、Snn3、Sm1、Tsn1、Yr36、Rpg5、および Lr9 は、異なるドメインに融合した単一またはタンデムプロテインキナーゼです 16、17、18、19、20、21、22 (拡張データ)図7および補足表20)。キナーゼ融合タンパク質の機能についてはほとんど知られていないが、ほとんどのタンパク質は、NLR 媒介耐性と表現型的に区別できない人種特異的耐性を与える。それらをコードする遺伝子は、成人、広域スペクトルおよび多病原体耐性の Lr34/Lr67 カテゴリーには分類されません 30,31。耐性におけるこれらのキナーゼの役割を説明するために、我々は現在その手口がよく理解されている NLR から手がかりを求めました。 NLR は、病原体エフェクターの標的となる宿主成分を監視するガードとして機能します 32。これらのガードはエフェクターとそのターゲットの間の相互作用を検出し、NLR の構造変化を引き起こし、下流の防御反応を引き起こします。この三者の相互作用は、(1) 病原性標的を強制する能力を維持しながら、NLR による検出を回避するようにエフェクターに選択圧力を課し、(2) 新しいエフェクター変異体を認識するように NLR に選択圧力を課す進化的な「綱引き」を生み出します。 (3) 細胞機能を維持しながらエフェクターによる破壊を回避するための病原性標的について。病原性標的の複製は、この機能的制約からそれを解放し、エフェクターに「おとり」を提供することができる。この多様化により、デコイが遺伝的に耐性遺伝子として機能する可能性もあります 33。すべての NLR の約 10% では、おとりは NLR 自体に組み込まれています 34。このようなガーディとデコイの融合により、両方のコンポーネントが単一の操作ユニットとして確実に継承されます。

外挿すると、プロテインキナーゼ融合タンパク質は、NLR によって保護される病原性標的である可能性があります。すべてのプロテインキナーゼ融合タンパク質は、1 つの見かけ上機能的なキナーゼを持ち、これが 2 番目の、通常は機能しないキナーゼドメインに融合されていますが、たとえば Sr43、Lr9、および Pm4 のように、完全に異なるドメインに融合している場合もあります (拡張データ図 7)。おそらく、統合されたデコイを運ぶ NLR と同様に、この 2 番目のドメインは統合されたデコイである可能性があり、一方、見かけ上の機能的なキナーゼがシグナル伝達機能を発揮します。実際、植物は、さまざまな基質の反応を触媒するために、さまざまな統合ドメインを持つプロテインキナーゼを含むさまざまな酵素を生成します。プロテインキナーゼ耐性タンパク質の場合、統合ドメインは病原体 Avr タンパク質の特定の基質を定義しますが、キナーゼは Avr タンパク質、統合ドメイン自体、または第 3 のシグナル伝達パートナーのリン酸化を触媒して下流の防御を引き起こします。おそらく NLR ガードを経由します (拡張データ図 8a)。 Yr15、Pm24、Sr62、および Sr43 の EMS 変異誘発は、キナーゼ活性部位または見かけの機能的キナーゼドメインの ATP 結合ポケットに影響を与えるミスセンス変異の優勢を示しており (拡張データ図 7)、キナーゼ媒介シグナル伝達が機能に必要です。あるいは、Sr43 (および外挿により他のキナーゼ融合耐性タンパク質) 35,36 は、NLR 共シグナル伝達パートナーなしで機能する可能性があります (拡張データ図 8b)。

異なるバックグラウンドでの Sr43 のトランスジェニック発現により、Sr43 の広範囲の有効性を確認することができ、抵抗性育種における Sr43 の潜在的な価値が強調されました。しかし、実験室条件下では、AvrSr43 機能を失った病原性獲得型変異体を取得することは可能です 37。したがって、野外での寿命を最大限に延ばすために、Sr43 を他の広域スペクトル耐性遺伝子と組み合わせて使用する必要があります。

私たちは小麦 Th の 2,700 個の種子を突然変異させました。 Sr43 を含む elongatum 遺伝子移入系統 RWG34 (参考文献 29)。乾燥種子を、ローラーミキサー（モデルSRT1、Stuart Scientific）上で一定に振盪しながら、200mlの0.8%（w/v）EMS溶液とともに16時間インキュベートし、種子のEMSへの最大限の均一な曝露を確保した。次いで、過剰な溶液を除去し、種子を水道水４００mlで３回洗浄した。 M1 種子を温室で栽培し、M2 ファミリー (単頭) の種子を収集しました。 M2 ファミリーあたり 8 つの種子を、Pgt 分離株、レース TPMKC で表現型解析しました。感受性 M2 植物に由来する M3 種子も試験して、M2 感受性植物が真の非分離変異体であることを確認しました。種子の汚染を除外するために、シーケンスによるジェノタイピング (GBS) を使用して 10 個の変異体が検証されました 38。バックグラウンド (中国の春)、ドナー種 (Th. elongatum、USDA-ARS GRIN からのアクセッション PI531737)、中国の春 - Th からの GBS データ。 elongatum Sr43 遺伝子移入系統 (RWG34) および変異系統は、BWA mem (v.0.7.12) と標準パラメーターを使用して、中国 Spring39 の参照ゲノム配列にマッピングされました 40。マッピング結果は、SAMtools41 (v.0.1.19) を使用してソートされ、mpilup 形式に変換されました。 Zenodo42 にリンクされた以前に公開されたカスタムスクリプトを使用して、mpilup ファイルを検査し、所定の間隔ごとに遺伝子移入系統と共有されるドナーからの一塩基多型の割合を計算しました。いくつかの間隔の長さをテストしました。 10 Mb 間隔で明確な信号が観察されました。

有糸分裂中期染色体の懸濁液を、参考文献に記載されているように、Sr43遺伝子移入系統の根端および8つのEMS変異体から調製した。 43および参考文献。 44. 簡単に言うと、根端分裂組織細胞をヒドロキシ尿素を使用して同調させ、アミプロホスメチルを使用して中期に蓄積させ、2% (v/v) ホルムアルデヒド中で 5 °C で 20 分間固定しました。無傷の染色体は、600 μl の氷冷 LB01 バッファー中で 100 個の根端を機械的に均質化することによって放出されました 45。 GAA マイクロサテライトは、参考文献に従って 5'-FITC-GAA7-FITC-3' オリゴヌクレオチド (Sigma) を使用した懸濁液中蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (FISHIS) によって単離された染色体上で標識されました。 46 と染色体 DNA を 2 μg/ml の 4',6-ジアミジノ 2-フェニルインドール (DAPI) で染色しました。染色体分析および分類は、FACSAria II SORP フローサイトメーターおよびソーター (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) を使用して実施されました。 FITC および DAPI 蛍光をプロットする二変量フロー核型をサンプルごとに取得し、染色体を 1 秒あたり 20 ～ 40 粒子の速度でソートしました。 Th を持つ染色体 7D の 55,000 コピーと 70,000 コピーの 2 つのバッチ。 Sr43を含むelongatum染色体セグメントを野生型Sr43-WTから選別し、14,000〜66,000コピーの1バッチを8つの変異体から40μlの滅菌脱イオン水を含むPCRチューブに選別しました（補足表3）。

フローソートされた画分の染色体含有量は、顕微鏡スライド上の 2.5% (w/v) スクロース 47 を含む PRINS バッファー 10 μl 滴にソートされた 1,500 ～ 2,000 個の染色体の顕微鏡観察によって推定されました。風乾した染色体を、pSc119.2 リピート、Afa ファミリーリピート、およびすべての小麦と Th の同定を可能にする 45S リボソーム DNA のプローブを使用して FISH によって標識しました。参考文献によると、elongatum染色体。 48. 選別された画分の染色体含有量と純度を決定するために、フローソートされた各サンプルの少なくとも 100 個の染色体が、参考文献に記載されている核型に従って分類されました。 49.

野生型遺伝子型の 2 つの別々にフローソートされた染色体サンプルを、2 つの配列決定ライブラリーの調製に使用しました。染色体サンプルをプロテイナーゼ K (60 ng μl-1) で処理し、その後 DNA を増幅せずに精製しました。変異体からフローソートされた染色体サンプルも同様に処理されましたが、参考文献に記載されているように、Illustra GenomiPhi v.2 DNA 増幅キット (GE Healthcare) を使用した多重置換増幅 (補足表 3) によって、DNA 含有量が 2.5 ～ 12.6 μg まで増幅されました。 50 であり、Novogene によって配列決定されました。 Sr43 野生型遺伝子型の場合、Bioruptor Plus (Diagenode) を HIGH 設定で 30 秒間 5 回使用して、20 ng の非増幅 DNA を 20 μl 容量で断片化しました。配列決定用のライブラリーは、以下の変更を加えた Illumina 用 NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit を使用して断片化 DNA から調製しました: (1) サイズ選択はより大きな最終ライブラリーサイズ (約 1,000 bp) を対象とし、(2) PCR 濃縮は6 PCR サイクル。ライブラリーは、HiSeq Rapid SBS Kit v.2 を 250 bp ペアエンドリードとして使用し、HiSeq2500 プラットフォームで配列決定されました。生データは、Trimmomatic51 を使用して低品質の塩基をトリミングし、111 ヌクレオチドの k-mer を使用して Meraculous52 (v.2.0.5) で足場に組み立てられました。 1 kb より短い足場は除去されました。このアセンブリには 168,523 個の足場が含まれており、アセンブリの全長は 1.29 ギガベース (Gb) でした。そのうち、25,581 個の足場は 13.9 kb より長く、全長は 631.8 Mb でした。

独立した M2 ファミリーに由来する 8 つの感受性変異体が MutChromSeq マッピング用に選択されました 53。 8 つの変異体からの生のリードは、BWA40 (v.0.7.12) および SAMtools41 (v.1.8) を使用して、10 kb の切断された足場フラグメントに個別にマッピングされました。すべての変異体において、1 つの断片に単一ヌクレオチド変異があることが確認されました。参考文献によって開発された式番号 4 を使用して、これが候補遺伝子である確率を計算しました。これは、平均遺伝子CDSの長さが1,000 bpであり、染色体7Dが5,822個の遺伝子を有すると仮定して、2,598 bpのSr43コード配列(CDS)を有する。同定されたすべての変異は、EMS 変異誘発に典型的な G から A または C から T への遷移変異でした。

総 RNA は、中国の Spring-Th から抽出されました。 elongatum Sr43 遺伝子移入株を、RNeasy Plant Mini Kit (カタログ番号/ID 74904、Qiagen) を製造業者のプロトコールに従って使用し、Dnase I (Roche) で消化しました。 RNA-seq は Novogene によって実行されました。 RNA-seq リードは Trimmomatic (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) でトリミングされました。 Hisat2 (v.2.1.0)54 を使用して、ショートリードを Sr43 ゲノム配列にマッピングしました。 SAM 出力ファイルは、SAMtools41 (v.1.8) (http://www.htslib.org/) を使用して BAM ファイルに変換され、Sr43 ゲノム配列に沿った位置に従って並べ替えられ、IGV (https:/) による視覚化のためにインデックス付けされました。 /software.broadinstitute.org/software/igv/)。 Sr43 の選択的スプライシングを決定するために、SMARTer PCR cDNA 合成キット (カタログ番号 634926、Clontech/TaKaRa) を使用して完全長 cDNA ライブラリーを構築しました。 4 つのスプライス変異体のそれぞれに対応する転写物は、Sr43 5 ' および 3 ' 末端に特異的なプライマーを使用した全長 cDNA ライブラリーでの長距離 PCR の形質転換から得られた 20 クローンのサンガー配列決定によって同定されました (補足表 5)。

遺伝子の注釈に基づいて、Sr43 遺伝子の 3 つの重複セグメントを、製造元の指示に従って高忠実度 Q5 DNA ポリメラーゼ (NEB) を使用して PCR 増幅しました (補足表 12)。 PCR産物をQIAquick PCR Purification kit (QIAGEN)で精製し、Taq DNAポリメラーゼを使用してA-tailedした後、pCR2.1ベクター(TOPO PCR Cloning Kits-K202020、Thermo Fisher Scientific)にクローニングしました。陽性クローンを 3 セットの制限酵素、NotI、NotI-PvuI、および PvuI-PmeI (NEB) で消化し、それぞれ Sr43 フラグメントパート 1、2、および 3 を生成しました。消化された断片をゲル精製し、次いでパート２および３を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｍ０２０２Ｓ、ＮＥＢ）を使用して、ＮｏｔＩおよびＰｍｅＩで消化されたバイナリーベクターｐＧＧＧ－ＡＨ－ＮｏｔＩ／ＰｍｅＩ１２との三方向ライゲーション反応で組み合わせた。続いて、バイナリ構築物を NotI で線状化し、パート 1 をドロップインしました。パート 1 が正しい方向にある陽性クローン pGGG-Sr43 が、サンガー配列決定によって検証されました。ｐＧＧＧ−Ｓｒ４３は、アクセッション番号１８６９７４でＡｄｄｇｅｎｅから入手可能である。

バイナリー構築物ｐＧＧＧ－Ｓｒ４３をコムギ品種に形質転換した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換を使用するフィールダー55。 Sr43 コピー数は、qPCR56 を使用して iDNA Genetics によって T0 および T1 植物におけるハイグロマイシン B ホスホトランスフェラーゼ選択マーカーのコピー数を試験することによって推定されました。非分離遺伝的に安定した T1 ファミリーから、さらなるコピー数試験のために T2 系統 (BW_30183) を開発しました。我々は、Sr43、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ選択マーカー遺伝子、および単一コピー、3コピー、および6コピーの小麦内因性対照遺伝子の遺伝子特異的プライマーを設計しました（補足表13）。内因性遺伝子のプライマー配列は、cv.に基づいて設計されました。野手参照ゲノム57。 QIAGEN ゲノム DNA ハンドブックに従って、1 g あたり 500 本のカラム (Qiagen、ロット 169047970) を備えた Qiagen ゲノム DNA 抽出キット (Qiagen、カタログ番号 19060) を使用して、単一の T3 植物 (T2 ファミリー BW_30183 に由来) から DNA を抽出しました。 qPCR は、1X SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (BioRad)、0.5 μM プライマー、および 2 ng μl-1 の DNA を使用した 10 μl の反応で、95 °C で 3 分間の初期変性、続いて 95 °C での変性を使用して実行されました。 CFX96 リアルタイム PCR システムで、60 °C で 15 秒間のアニーリング + 伸長を 40 サイクル、60 °C で 30 秒間行います。 Sr43 遺伝子のコピー数は、内在性参照遺伝子に基づいて計算されました (補足図 17 および補足表 14)。

茎さび試験は温室または生育室で実施されました。温室/生育チャンバーは、14 時間の明期および約 40% の相対湿度で 21 °C に維持されました。植物にP.グラミニスfを接種した。 sp. 播種後 10 ～ 12 日後、2 番目の葉が完全に展開したときのコムギの胞子は、植物あたり約 0.12 mg の割合で発生しました。高湿度 (100%) 条件下、暗所で 16 時間培養した後、接種した苗を温室/生育チャンバーに戻し、12 ～ 14 日後に茎さび病に対する反応を記録しました。感染の種類は、Stakman スケールを使用して記録されました58。温度感度テストでは、高温を 26 °C に設定しました。この研究で使用された Pgt レースは、米国の TPMKC (分離株 74MN1409) でした。 QTHJC (75ND717C および 69MN399 を分離) 米国から。エチオピアからのTKTTF（ET11a-18を分離）。ケニアからのTTKTT（KE184a/18を分離）。イスラエルからの TKTSC (分離株 IS no. 2079)、TTTTF (分離株 IS no. 2127)、および TTTTC (分離株 IS no. 2135)。フランスからのTKTTF（FR68-20を分離）。イタリアからのTTRTF（IT16a-18を分離）。 TKTTF (UK-01 を分離) 英国から。およびジョージア州からのTRTTF（分離14GEO189-1）（補足表15）。

InterPro v.88.0 を使用して、Sr43 のタンパク質ファミリードメイン、たとえば膜貫通ドメインを検索しました 59。ミリストイル化部位と核局在シグナルの存在を確認するために、それぞれ Myristoylator60 と cNLS マッパー 61 を使用しました (2023 年 3 月 11 日にアクセス)。

AlphaFold v.2.0 (参考文献 26) のオープンソースコードと、キングアブドラ科学技術大学 Shaheen II のスーパーコンピューター (https://www.hpc.kaust.edu.sa/) をマルチノードシステム経由で使用しました。アイベックス (https://www.hpc.kaust.edu.sa/ibex)。 Sr43 のアミノ酸配列を入力すると、5 つの非緩和モデル、5 つの緩和モデル、5 つのランク付けモデルが .pdb 形式で出力されました。ここでは、70.76 という最高の局所距離差分テスト (lDDT) スコアを備えた、最も信頼性の高い予測を含む Rank_1.pdb モデルを使用しました。次に、Alphafold から取得した Rank_1.pdb モデルと各ドメインを別々にタンパク質構造比較サーバー Dali27 に入力します。

我々は、低分子結合部位スクリーニング 28 用の Web サーバーである HADDOCK2.4 を使用して、潜在的な ATP 結合部位について DUF2 ドメインをスクリーニングしました。入力ファイルは、.pdb ファイルからすべてのループを削除した後の Sr43 の DUF2 ドメインと .pdb 形式の ATP で構成されていました。使用した設定は次のとおりです。

アクセス可能な残基からランダムに曖昧な相互作用制約を定義します - オン

剛体ドッキング用の構造の数 - 10,000

セミフレキシブルリファインメント用の構造の数 - 400

最終改良のための構造の数 - 400

クラスタリング手法 (RMSD または共通連絡先の一部 (FCC)) - RMSD

クラスタリングの RMSD カットオフ (推奨: RMSD の場合は 7.5 A、FCC の場合は 0.60) - 2.0

EVDW 1—1.0

エエレック 3—0.1

界面に柔軟なサイドチェーンを備えた 2 回目の TAD 冷却ステップの初期温度 - 500

完全に柔軟なインターフェースを備えた 3 回目の TAD 冷却ステップの初期温度 - 300

剛体の高温 TAD の MD ステップ数 - 0

最初の剛体冷却段階での MD ステップ数 - 0

出力ファイルは、異なる予測された ATP 結合部位の 10 個のクラスターでした。最高の予測スコア (Z スコア) を持つクラスターはクラスター 6 でした。

Sr43 のネイティブ CDS に CDS の先頭に 2 つの追加ヌクレオチド (CC) を加えたもの (His6 タグによるオープンリーディングフレームを維持するため) を商業的に合成し (Twist Bioscience)、ゲートウェイエントリーベクター pTwist_ENTR にクローニングしました。組換えタンパク質の発現のために、Sr43 を Gateway LR クロナーゼ反応 (Invitrogen) によって発現ベクター pDEST-His6-MBP に導入しました。得られたクローンはサンガー配列決定によって検証されました。

His6-MBP-Sr43 タグ付きタンパク質は、細菌培養物を 37 °C で光学密度 OD600 が 0.8 になるまで増殖させ、その後 0.5 mM イソプロピル β-d-チオガラクトピラノシドを 30℃ で添加してタンパク質発現を誘導することにより、大腸菌ロゼッタ株で発現させました。 18 °C で培養物をさらに 14 ～ 16 時間インキュベートします。組換えタンパク質は、製造業者の指示に従って、Ni-NTA アガロースビーズ (Invitrogen カタログ番号 R901-15) を使用して、ネイティブ条件下で精製されました。

精製した His6-MBP-Sr43 タンパク質の緩衝液組成を、PD10 脱塩カラム (GE) を使用してキナーゼ反応緩衝液 (20 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl2、5 mM EGTA、1 mM DTT および 50 μM ATP) に変更しました。健康管理）。 His6-MBP-Sr43 を市販の基質マルトース結合タンパク質 DNA ジャイレース (Prospec Protein Specialists PRO-616) と混合し、周囲温度で 30 分間インキュベートしました。 SDSサンプルバッファーを加えて反応を停止させた後、95℃で10分間煮沸することによりタンパク質を変性させました。 SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してタンパク質サンプルを分離しました。ゲルを SimplyBlue SafeStain (Novex カタログ番号 LC6065) で染色し、目的のタンパク質に対応するバンドを切り出し、0.5 mm3 の断片に切断し、アセトニトリルと 100 mM NH4HCO3 でそれぞれ 15 分間の 4 回の連続洗浄で脱染しました。。ゲル片中のタンパク質を、100 mM NH4HCO3 中の 10 mM トリス (2-カルボキシエチル) ホスフィン塩酸塩 (TCEP、C-4706 Sigma) を用いて 37 °C で 1 時間還元しました。次いで、還元されたジスルフィド結合を、50 mM ヨードアセトアミドを用いて周囲温度で30分間アルキル化した。タンパク質の還元とアルキル化に続いて、タンパク質をトリプシン (ブタトリプシン、Promega) で 37 °C で一晩消化しました。ギ酸を最終濃度１％まで添加して消化を停止し、ゲル片をアセトニトリル中でインキュベートすることによってトリプシンペプチドを回収した。回収されたペプチドは、Sep-Pak C18 1 ml vac カートリッジ (Waters SKU: WAT023590) を使用して脱塩され、タンデム質量分析計 (LC-MS/MS) を備えた液体クロマトグラフィーによって分析されました (補足図 14)。ペプチドサンプルは、Orbitrap Fusion Lumos 質量分析計 (Acclaim PepMap C18、長さ 25 cm、ID 75 m、粒径 3 m、多孔度 100、Dionex) に接続された C18 カラムを使用して分離しました。 LC 勾配は、45 分間かけて 5% 溶媒 B (水/ACN/ギ酸、20/80/0.1、v/v/v) から 45% 溶媒 B まで増加し、その後 10 分間かけて 90% 溶媒 B まで増加しました。 Orbitrap Fusion Lumos 機器で HCD 断片化を使用して、MS 機器は上位 10 個のペプチドの断片化スペクトルを記録しました。 msConvert インターフェイスを使用して、RAW データファイルを MGF ファイルに変換しました。 Mascot サーバーを使用してデータベース検索を実行し、次の基準を使用しました。(1) Sr43、MBP、および夾雑タンパク質のアミノ酸配列を含むデータベース。 (2) 酵素特異性 (トリプシンは 2 つの切断ミスを許容します)。 (3) システイン残基が固定的に修飾されています (カルバミドメチル)。 (4) S、T、および Y 残基のリン酸化はさまざまに修飾される可能性があります。 (5) 前駆体質量は 5 ppm まで許容可能です。 (5) フラグメントイオンは 0.02 Da まで許容されます。マスコットスコアとMDスコアを使用して所見をフィルタリングしました。マルトース結合タンパク質のタンパク質範囲を決定するために同定されたペプチドを、単独でインキュベートした場合およびHis6-MBP-Sr43とインキュベートした場合を示します（補足図15および16）。

35S:Sr43-GFP構築物を生成するために、Sr43スプライスバージョン1のコドン最適化オープンリーディングフレームを合成し、pDONR221(Twist Bioscience)に連結した。次いで、エントリークローンを、単一ゲートウェイＬＲ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってバイナリーベクターｐＢ７ＦＧＷ２，０に導入した。 35S:PLSP2A-mRFP コンストラクトは、PLSP2A CDS のエントリークローンを p35S プロモーターおよび mRFP 蛍光レポーターと、逐次的な Gateway クローニングを使用して組み合わせることによって生成されました。

35S:Sr43-GFP および 35S:PLSP2A-mRFP 構築物を、参考文献に記載されているように A. tumefaciens 株 GV3101 に移し、タバコの葉に浸潤させました。 62. GFP シグナルは 488 nm で励起され、500 ～ 535 nm で検出されました。 mRFP シグナルは 555 nm で励起され、566 ～ 646 nm で検出されました。画像は、HC PL APO 63× 1,2 W CORR UVIS CS2 対物レンズを備えた倒立型 Leica SP8 Stellaris FALCON を使用して取得されました。

pZmUbi:GFP-Sr43 コンストラクトを生成するために、スプライスバージョン 1 Sr43 CDS を、さらなる Golden Gate クローニングのためのレベル I モジュールとして、上記の pDONR221 から pJET1.2 ベクター (Thermo Fisher) にサブクローニングしました 63。レベル II 発現構築物は、レベル II バックボーン (BB10)、レベル I Zmユビキチンプロモーター、レベル I GFP タグ、レベル I Sr43 およびレベル I NOS ターミネーターを用いて、BsaI カットライゲーション反応を介して構築されました 63。 pZmUbi:NLS-mCherry 構築物は、レベル II バックボーン、レベル I ZmUbqiuitin プロモーター、レベル I 核局在化配列、レベル I mCherry およびレベル I NOS ターミネーターを組み合わせることにより、同様の方法で生成されました。 pZmUbi:GFP コントロールは、LR クロナーゼ反応を介して GFP CDS を pZmUbi:GW64 に移すことによって生成されました。

プラスミドDNAを、NucleoBond Xtra Maxi Plus Kit (Macherey-Nagel)を用いて、pZmUbi:GFP-Sr43、pZmUbi:NLS-mCherry、pZmUbi:GFPを保有する大腸菌から精製した。葉肉細胞は、短日条件 (8 時間明所、16 時間暗所) で生育した生後 9 日の小麦苗 (品種: フィールダー) から単離されました。プロトプラストの単離とトランスフェクションは、参考文献に記載されているように実行されました。 64.

蛍光は、Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 対物レンズを備えた Carl Zeiss LSM 正立 880 Axio Imager 2 共焦点顕微鏡で観察しました。 GFP はアルゴンレーザー (488 nm) を使用して励起され、494 ～ 552 nm で検出されました。 mCherry はダイオード励起固体レーザー (561 nm) を使用して励起され、596 ～ 649 nm の間で蛍光が検出されました。

我々は、NCBIタンパク質データベースに対してキナーゼドメイン配列およびSr43 DUF領域配列の100のベストヒット（ID≧75％）の整列したタンパク質配列に基づいて系統樹を構築した。キナーゼおよび DUF ドメインの系統樹 (隣接結合法) は、Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) で計算され、iTOL (https://itol. embl.de/)。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、次のように公開されています。配列リードは、プロジェクト番号 PRJEB52878 (GBS データ)、PRJEB51958 (染色体フローソートデータ)、および PRJEB52088 (RNA-seq データ) で European Nucleotide Archive に寄託されました。 Sr43 遺伝子および転写配列は、アクセッション番号 ON237711 で NCBI Genbank に寄託されました。 Sr43 染色体アセンブリは Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.6777941) に寄託されています。この研究では次の公開データベース/データセットが使用されました: Chinese Spring リファレンスゲノム 39、Gramene (http://www.gramene.org/)、https://ensembl.gramene.org/Multi/Tools/Blast、https:/ /wheat.pw.usda.gov/GG3/blast、BLAST 非重複タンパク質配列 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)、分類ブラウザ ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=1437183)、AlphaFold26 (https://alphafold.ebi.ac.uk)、Dali27 (http://ekhidna2. biocenter.helsinki.fi/dali/) および HADDOCK28 (https://www.bonvinlab.org/education/HADDOCK-binding-sites/)。

これらの分析で使用されるスクリプトは GitHub (https://github.com/steuernb/GBS_introgression_line_analysis) で公開されており、Zenodo (https://zenodo.org/badge/latestdoi/394326594) にリンクされています。

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サウル、IMLら。一致する病原体 AVR エフェクターと植物 NLR 免疫受容体の同定と検証のための大麦および小麦プロトプラストにおける細胞死アッセイ。植物法 15、118 (2019)。

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表現型解析と補足表 19 の編集にご協力いただいた Y. Wang に感謝します。培地準備には ES Vande Loo。 H. Zhang と AW Weatherhead が質量分析について協力してくれました (いずれも KAUST、サウジアラビア)。 Y. Jin (USDA-ARS、ミネソタ州、米国) Pgt 分離株 74MN1409、75ND717C、69MN399 および 14GEO189-1 の使用について。 M. van Slageren (キュー、英国) 種の命名法について協力してくれました。 S. Saile と L. Rohr (ドイツ、テュービンゲン大学) pZmUbi および NLS Golden Gate モジュールについて。フローサイトメトリー用の染色体サンプルの調製については、Z. Dubská、R. Šperková、および J. Weiserová。染色体分類には M. Said と P. Cápál (いずれも IEB、チェコ共和国)。この研究は、NBI Research Computing グループと英国ジョンイネスセンターの情報学プラットフォームによって支援され、米国 2Blades Foundation から BJS と BBHW への資金提供を受けました。バイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会 (BBSRC) BBHW に対する将来の小麦研究機関横断的戦略プログラムの設計 (BBS/E/J/000PR9780)。マリー・キュリー・フェローシップ助成金賞「AEGILWHEAT」（H2020-MSCA-IF-2016-746253）およびハンガリー国立研究開発イノベーション局（K135057）をIMに授与。 ERDF プロジェクト「持続可能な世界開発のためのツールとしての植物」(番号 CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827) を JB、KH、MK、JD に提出。キング・アブドラ科学技術大学からBBHW、Ł.J.、IB、HHへ。ミネソタ大学のリーバーマン・オキナウ基金をBJSに寄付。ダイムラー・ベンツ財団、ドイツ研究財団 (DFG) CEPLAS (EXC 2048/1—プロジェクト ID: 390686111) および DFG エミー・ネーター・プログラム (SA 4093/1-1) による IMLS。ゴードン＆ベティ・ムーア財団は、GBMF4725 を 2Blades 財団と JDGJ に助成金として提供します。とギャツビー慈善財団から JDGJ へ

T・リン・ルーバー

現在の住所: Enko Chem、ミスティック、コネチカット州、米国

イシュトヴァーン・モルナル

現在の住所: 農業研究センター、ELKH、農業研究所、マルトンヴァーサール、ハンガリー

サウジアラビア、トゥワル、キング・アブドラ科学技術大学 (KAUST)、生物環境科学工学部門 (BESE)、植物科学プログラム

Guotai Yu、Naganand Rayapuram、Fatimah R. Aljedaani、Catherine Gardener、Jesse Poland、Heribert Hirt、Ikram Blilou & Brande BH Wulff

砂漠農業センター、KAUST、トゥワル、サウジアラビア

Guotai Yu、Naganand Rayapuram、Fatimah R. Aljedaani、Catherine Gardener、Jesse Poland、Heribert Hirt、Ikram Blilou & Brande BH Wulff

ジョン・イネス・センター、ノリッジ・リサーチ・パーク、ノリッチ、英国

Guotai Yu, Catherine Gardener, Yajuan Yue, Ngonidzashe Kangara, Burkhard Steuernagel, Sadiye Hayta, Mark Smedley, Wendy Harwood & Brande BH Wulff

米国ミネソタ州セントポールのミネソタ大学植物病理学教室

オアディ・マトニー、ライアン・ジョンソン、マシュー・N・ラウズ、ブライアン・J・ステフェンソン

バイオサイエンスプログラム、スマートヘルスイニシアチブ、BESE、KAUST、トゥワル、サウジアラビア

スピリドン・グルドゥピス & ウカシュ・ジャレムコ

テュービンゲン大学（ドイツ、テュービンゲン）、植物分子生物学センター（ZMBP）、植物生化学教室

ヤン・L・ワン＆トルステン・ニュルンベルガー

ケルン大学植物科学研究所、ケルン、ドイツ

エマ E. クリーン & イザベル M.-L. サウル

Cluster of Excellence on Plant Sciences (CEPLAS)、ケルン、ドイツ

イザベル M.-L. サウル

オーフス大学、スラーゲルセ、デンマーク、アグロエコロジー学部

メヘランパプール

カンザス州立大学、植物病理学部門、米国カンザス州マンハッタン

Shuangye Wu & ジェシー・ポーランド

セインズベリー研究所、イースト・アングリア大学、ノリッジ、英国

ジョナサン D.G. ジョーンズ

2Blades Foundation、米国イリノイ州エバンストン

T・リン・ルーバー

テルアビブ大学穀物研究所、テルアビブ、イスラエル

Moshe Ronen

イスラエル、テルアビブのテルアビブ大学、穀物研究所および植物科学および食料安全保障学部

アミール・シャロン

USDA-ARS、穀物疾患研究所、米国ミネソタ州セントポール

マシュー・N・ラウズ

作物改良および遺伝学研究ユニット、USDA-ARS、西部地域研究センター、米国カリフォルニア州アルバニー

スティーブン・シュー

バイオテクノロジーおよび農業研究のための地域ハナセンター、チェコ科学アカデミー実験植物研究所、オロモウツ、チェコ共和国

カテジナ・ホルショヴァ、ヤン・バルトシュ、イシュトヴァーン・モルナール、ミロスラヴァ・カラフィアトヴァ、ヤロスラフ・ドレジェル

紅海研究センター、BESE、KAUST、トゥワル、サウジアラビア

ウカシュ・ジャレムコ

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GY は突然変異体集団を生成しました。 RJ、BJS、NK は変異体をスクリーニングして検証しました。 BS、SW、JP の遺伝子型別変異体。 IM、MK、JD は染色体フローソーティングと増幅を実行しました。 GY、KH、JB が染色体構築を行いました。 GY は Sr43 を特定するためにバイオインフォマティクス分析を実行しました。 GY は RNA を抽出し、Sr43 遺伝子の構造と選択的スプライシングを決定しました。 GY、SG、Ł.J. Sr43 に注釈が付けられています。 SG と Ł.J. 3Dモデリング解析を行いました。 MS はバイナリーベクターを開発しました。 GY は Sr43 構築物を設計しました。 SH と WH は Sr43 を小麦に変換しました。 GY、OM、MP、および MNR はトランスジェニック系統の表現型を決定しました。 FRAおよびIB（N.ベンサミアナ内）およびYLW、EEC、TNおよびIM-LS（コムギ内）により、Sr43の局在が決定された。 NRとHHはキナーゼアッセイを実施しました。 GY は系統発生学とシンテニーを実行しました。 OM、SX、MNR、MR、AS、JDGJ、CG、YY、TLR は、生殖質、さび培養、または科学的なサポートとアドバイスを提供しました。 BBHW、GY、BJS がこの研究を発案しました。 GY と BBHW が原稿を作成しました。共著者全員が最終原稿を読んで承認しました。著者リストでは、最初の 6 名と最後の 6 名を除き、著者は機関ごとにグループ化されています。

Brian J. Steffenson または Brande BH Wulff への通信。

GY と BBHW は、2Blades によって出願された、トランスジェニック小麦の茎さび病抵抗性のための Sr43 の使用に関する米国仮特許出願 63/250,413 の発明者です。 TLR は 2Blades Foundation によって雇用され、この研究に共同資金を提供しました。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Genetics は、この研究の査読に貢献してくれた Tzion Fahima 氏、Zhiyong Liu 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

DAPI (x 軸) 対 FITC (y 軸) のドットプロットは、GAA および ACG マイクロサテライト用の FITC 結合プローブを使用して FISHIS によって標識された DAPI 染色染色体懸濁液の分析後に得られました。 7D/7el2 転座染色体は、赤い四角で示されているソートウィンドウから純度 60 ～ 65% でソートされました。挿入図: 選別画分の染色体を同定するために使用した、pSc119.2 リピート (緑色)、Afa ファミリーリピート (赤色)、および 45S rDNA (黄色) のプローブを使用した FISH 後の 7D/7el2 転座染色体。染色体は DAPI で対比染色されました (青)。

a、葉トランスクリプトームからのRNA-seqリードのSr43遺伝子座へのマッピング。 b、全長cDNAクローンの配列決定によって同定されたmRNAスプライスバリアント。イントロンとエクソンは、それぞれ線とボックスで表されます。スプライスバリアント 1、2、3、および 4 には、コード配列内にそれぞれ 8、7、5、および 6 個の EMS 誘発変異があります。

ａ、ベンサミアナタバコにおける、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターによって駆動されるＳｒ４３－ＧＦＰ融合構築物またはＧＦＰ構築物のアグロバクテリウム媒介一過性発現。表皮細胞における GFP 蛍光を、浸潤後 3 日目に共焦点レーザー走査顕微鏡により記録しました。 b、N.ベンタミアナにおける 35 S:PLSP2A-RFPプラスチドマーカー構築物を有する 35 S:Sr43-GFPのアグロバクテリウム媒介一過性発現。表皮細胞における GFP または RFP の蛍光を、浸潤後 3 日目に共焦点レーザー走査顕微鏡によって記録しました。 c、小麦葉肉細胞におけるZmUbi:NLS-mCherry核マーカーを有するZmUbi:GFP-Sr43融合構築物(上のパネル)および対照としてのZmUbi:GFP(下のパネル)の一過性発現。 GFP および mCherry の蛍光は、トランスフェクションの 16 ～ 20 時間後に共焦点レーザー走査顕微鏡によって記録されました。非形質転換細胞は黒い矢印で示されます。すべての画像のスケールバーは 20 μm です。核 (N)、細胞質 (C)、および色素体 (P) は画像上に白い矢印で示されています。 GFP および Sr43-GFP 融合タンパク質のサイズは、それぞれ 27 kDa および 126 kDa と推定されます。実験をそれぞれ5回(Sr43-GFP、パネルa)、2回(GFP、パネルb)、3回(パネルb)、5回(GFP-Sr43)、および2回(GFP)の独立した実験で繰り返し、同様の結果が得られた。 N. ベンサミアナの実験では、2 枚の葉に浸潤し、葉ごとに 100 以上の核をスクリーニングしました。

a、非トランスジェニック親品種フィールダーと並んで世代T1からのホモ接合トランスジェニック系統。 b、世代T2からのホモ接合性トランスジェニック系統およびヌル分離株。スケールバー、1cm。

94% のカバレッジと 60% 以上の同一性の最小しきい値が適用されました。 ATSS、Aegilops tauschii subsp. 絞め殺された HVSV、Hordeum vulgare subsp. 下品な; LR、ロリウム・リジダス。 OS、ライスサティバ。 PV、Panicum virgatum。 SI、イタリアのセタリア。 TA、夏小麦。 TD、Triticum dicoccoides; TTSD、Triticum turgidum subsp. 難しい ZM、ゼアメイズ。

99% 以上のカバレッジと 70% 以上の同一性の最小閾値が適用されました。 ATSS、Aegilops tauschii subsp. 絞め殺された BD、Brachypodium distachyon。 DE、亡命デジタリア。 EC、Eragrostus curvula; HV、バルデウムオカダンゴムシ。 HVSV、Hordeum vulgare subsp. 下品な; LR、ロリウム・リジダス。 ML、Miscanthus lutarioriparius。 OB、オリザ・ブラキヤンサ。 OMVG、Oryza meyeriana var. 粒状 OS、ライスサティバ。 OSIG、インディアンライスグループ。 OSJG、ライスサティバジャポニカグループ; PH、パニカム・ハリイ。 PHVH、Panicum Hallii var. ホールの。 PM、Panicum miliaceum。 PV、Panicum virgatum。 SI、イタリアのセタリア。 SV、セタリアヴェルディ。 SB、ソルガムバイカラー。 TA、夏小麦。 TD、Triticum dicoccoides; TTSD、Triticum turgidum subsp. 難しいあなた、ウラルトゥの小麦よ。 ZM、ゼアメイズ。 ZP、湿地の雑草。

キナーゼの ATP 結合部位と活性部位は、Interpro スキャニング、AlphaFold 由来 3D モデルおよび/または BLAST での相同性検索によって決定されたように、それぞれ活性キナーゼと擬似キナーゼのボックスと丸で示されます。白いバーは、EMS 変異体スクリーニングから得られた機能喪失型ミスセンス変異を示します。リンカードメイン内の 8 つの変異は示されていません。タンパク質は上から下に出版日順に整理されています: Rpg1、Yr36、Tsn1、Rpg5、Yr15、Sr60、Pm24、Sm1、Snn3、Pm4 (スプライスバージョン 2 によってコードされる)、WTK4、Rwt4、Sr62 (参考文献 9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21)、Sr43 (この研究)、および Lr9 (参考文献 22)。 START、ステロイド生成性急性調節タンパク質関連脂質移動。 NLR、ヌクレオチド結合およびロイシンリッチリピート。 MSP、主要な精子タンパク質。 C2、C2ドメイン; PRT C、ホスホリボシルトランスフェラーゼ C 末端ドメイン。 DUF、機能不明のドメイン。 vWA、フォンヴィレブランド要素タイプ A ドメイン。白いバーは、EMS 由来の機能喪失型変異 (早期終止コドン変異を除く) が存在する位置を示します。 Lr9 の活性キナーゼの活性部位の下にある数字 9 は、9 つの変異が存在することを示しています。

プロテインキナーゼ (PK) 融合タンパク質には、無毒性エフェクタータンパク質 (赤い四角) を捕捉する統合デコイ (ID) が含まれています。これにより、プロテインキナーゼまたはデコイ、エフェクター、またはヌクレオチド結合ロイシンリッチリピート (NLR) ガードのいずれかの自己リン酸化が引き起こされます。これにより構造変化が起こり、信号カスケードが引き起こされ、下流の防御反応と免疫につながります。

補足図。 1～17。

補足表 1 ～ 20

AlphaFold によって予測された Sr43 の 3 次元モデル。

AlphaFold によって予測された、ATP を含む Sr43 の 3 次元モデル。

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転載と許可

Yu、G.、Matny、O.、Gourdoupis、S. 他。小麦茎さび病抵抗性遺伝子 Sr43 は、珍しいプロテインキナーゼをコードしています。ナット・ジュネ (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41588-023-01402-1

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受信日: 2022 年 7 月 3 日

受理日: 2023 年 4 月 18 日

公開日: 2023 年 5 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-023-01402-1

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自然遺伝学 (2023)