一般的に使用される添加剤を含むエラストマーシリコーンフォームにおける微生物の増殖と大腸菌の付着

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8541 (2023) この記事を引用

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3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

シリコーンは、撥水性が求められる環境でよく使用されます。水との接触により、微生物の付着とバイオフィルムの形成が促進されます。用途によっては、食中毒や感染症の可能性、材料の外観の劣化、製造上の欠陥の可能性が高まる可能性があります。微生物の付着とバイオフィルムの形成の防止は、人体と直接接触して使用されるが洗浄が難しいシリコーンベースのエラストマーフォームにとっても不可欠です。この研究では、さまざまな組成のシリコーンフォームの細孔内での微生物の付着と細孔からの滞留が説明され、一般的に使用されるポリウレタンフォームの細孔と比較されます。洗濯サイクル中の細孔内でのグラム陰性大腸菌の増殖とその浸出は、細菌の増殖/阻害、接着アッセイ、および SEM イメージングによって特徴付けられます。材料の構造特性と表面特性が比較されます。一般的な抗菌添加剤を使用しているにもかかわらず、不溶性粒子がシリコーンエラストマー層内で孤立したままとなり、表面の微細粗さに影響を与えることがわかりました。水溶性タンニン酸は培地に溶解し、浮遊細菌の増殖の阻害に役立つと思われ、SIF の表面でタンニン酸が利用可能であることが明確に示されています。

シリコーンは、幅広い用途を持つよく研究された材料です。それにもかかわらず、特定の用途におけるその抗菌特性には依然として疑問が生じています。医療用途では、シリコーンベースのフォーム (SIF) は主にプロテーゼ 1 および最新の創傷被覆材 2、3 として使用され、体組織や体液と常に接触しています。環境の湿度と水は微生物の付着によるバイオフィルムの形成を促進するため、そのような条件は間違いなく感染の可能性を高めます。 SIF のもう 1 つの急速に成長している応用分野は、体液、食品、液体と時折接触する可能性が高いクッション (シート、マットレス、ガスケット) です。クッションフォームは多くの場合、空気、液体、微生物の浸透を可能にする連続気泡構造を持っています。バイオフィルムの形成は材料の外観を劣化させ、製造欠陥の可能性を高めるため 4,5、シリコーン材料上の微生物の付着とバイオフィルムの形成の防止は、その用途に関係なく重要な課題です。

ポリ（ジメチルシロキサン）、例えば一般にシリコーンとして知られるＰＤＭＳベースのポリマーは、本質的に抗菌性ではない。白金ナノ粒子 6 を含む触媒や、ポリマー鎖間に組み込まれた、またはポリマー主鎖にグラフトされたその他の低分子量種などの添加剤は、シリコーン抗菌活性を与える可能性があります 7、8、9。表面張力が低く、したがって疎水性が高いことが、PDMS がタンパク質の吸着や細菌の付着を起こしやすい主な理由の 1 つであると報告されています 10,11。たとえば、Busscher et al. カンジダ・アルビカンスとカンジダ・トロピカリスを比較したところ、微生物の表面が疎水性であればあるほど、シリコン表面に付着しやすいことが分かりました4。グラム陰性菌である大腸菌は外膜層に疎水性領域と親水性領域の両方を持っていますが、その表面は一般に親水性であると考えられています（濡れの接触角は16.7°〜24.7°の範囲であると報告されています）12,13。微生物の付着は細菌細胞とポリマー表面の間の疎水性相互作用に依存することが一般に理解されています13。

疎水性表面への親水性細菌の付着を抑制するために、表面の親水性を高めることが可能な解決策として提案されることがよくあります10、14、15。シリコーンカテーテルへの大腸菌の付着は、硬化した PDMS に抗菌ペプチドとポリビニルピロリドンをグラフトすることによって 32% 減少することが示されており、ビニル修飾メチルセルロースを使用することによって最大 95% まで減少することが示されています 16。また、カルボキシメチルキトサンとポリドーパミンを使用すると、大腸菌の付着が 90% 以上減少15。また、シリコーンゴム（シュードモナス属、カテーテル）にアクリレート7をグラフトすることにより、非特異的なタンパク質の吸着や細胞接着を効果的に抑制し、表面の疎水性回復を抑制します。 McVerry らによる最新の研究の 1 つ。は、周囲条件および UV 光下での 1 段階の親水性表面改質に成功し、両性イオンポリマーポリスルホベタインおよびパーフルオロフェニルアジドのネットワークをシリコーン表面上に作成することに成功したことを示しています。報告された抗菌活性は、親水性コーティングの存在下での表面水和層の形成によるものでした。

モノリスシリコーンでは上記の表面改質が成功し、材料表面を均一に加工することができます。しかし、高多孔質で低密度の連続気泡の SIF を構造全体にグラフトすることはさらに困難になります。空気が満たされた大量の体積を水中に沈めるのは面倒で時間がかかります。また、成型の際、製造工程上部分的に皮が形成されます。最も重要なことは、疎水性の性質が、特にクッションや断熱の用途において、その表面や細孔から水を阻止するのに好都合であるということです。表面を親水基で官能化すると、水分を阻止する性質が失われ、スポンジ状の素材として機能します。

材料の疎水性を維持するために、粒子の形で局所的な抗菌部位を追加することが可能であり、これにより微生物の増殖を抑制することができます。これらの粒子は、硬化および発泡形成プロセスにおける細孔壁の薄化中に部分的に表面に現れる可能性がありますが、材料の中に埋め込まれたままになります。このような製造方法は、成分の重合と分散に基づいており、抗菌添加剤の摩耗を回避します。

シリコーンに抗菌特性を適用するには、さまざまな銀種（ナノ粒子、塩、イオン）を組み込むことが、長年にわたって主要な研究方向の 1 つでした 18、19、20、21。創傷被覆材は疎水性シリコーンと併用すると、創傷から細菌を抽出する効果があり、同時に殺菌作用もあることがわかっています2。無機ナノ粒子、Ag、ZnO、TiO2 は大腸菌に対して高い抗菌効果を示しますが、それらを有効濃度で使用すると機械的特性が大きく変化します20。材料が大量の場合は、いくつかの低コストの添加剤や充填剤をフォームマトリックスに組み込むことができます。たとえば、タンニン酸 22、23、24、シュンガイト 25、キトサン 26、マイカ、亜鉛ベース 27 は抗菌活性を示しています。

シリコーンフォーム上の微生物の活性は、主に市販の創傷被覆材 2,19 について、定性的 (ゾーン阻害など) および定量的 (細菌生存率アッセイ) 試験を通じて調査されています。粉末形態では、過酸化物硬化した高密度 SIF の抗菌活性を試験するために振盪フラスコ法が使用されており、抗菌効果は（後）硬化したフォームから漏れ出る有毒な添加剤に依存します 28。さまざまな創傷被覆材について、ゾーン阻害試験の結果が多孔質材料表面の疎水性と比較されています2。未発泡シリコーンエラストマーの場合、未処理の多孔質膜は静菌活性や殺菌活性を示さないことも示されています29。

最近、振盪フラスコ法に基づいて柔軟な気泡ポリマーを試験するための標準化された方法 ISO 23641:202130 が発行され、抗菌効果を評価するためのガイドとして使用できます。場合によっては、簡略化されたプロセスを効果的に適用できる可能性があります。

この研究は、容易に入手でき、したがって工業的に実現可能な、さまざまな鉱物および有機添加剤を含むポリシロキサンフォームの抗菌活性に焦点を当てています。比較のために、ポリウレタンベース (PU または PUR) フォームとその抗菌活性を評価します。これは、PU が前述の用途などで最も広く使用されている材料であるためです。 PU フォームとその抗菌添加剤 (創傷被覆材 19、膜 31、複合材料 31、およびコーティング 31) については広範な研究が行われていますが、SIF に関しては、この分野が常に進化しているため、多くの研究上の疑問がまだ解決されていません。さらに重要なのは、両方の素材がシートやマットレスのクッション層として使用されていることです。エラストマーシリコーンフォームは、クッション性、振動減衰性、断熱性32、医療用途においてますます関心を集めているため、その抗菌特性を調整することで、すでに優れた性質に付加価値を加えることができます。

この実験は、フォーム中のさまざまな添加剤と基材の違いが、25 °C で 24 時間以内の接種懸濁液中の細菌の増殖にどのような影響を与えるかを示しています。テストキューブを囲むルリア・ベルターニ培地（LBブロス）中の大腸菌濃度の結果を図1に示します。フォームキューブは培地に浸漬されているため、細菌と担持培地を自由に透過します。大腸菌濃度は、純粋なキューブを含まない増殖培地および抗菌効果を示唆するキューブの周囲とは異なることが予想されます。このため、対照実験として、純粋な接種混合物 (フォームなし) と抗菌添加剤 (SIF) を含まない標準的なシリコーンフォームについて同じテストを実施しました。

立方体サンプルの周囲の増殖培地と泡状サンプルのない培地における大腸菌濃度の変化。標準的な SIF との大きな違いは、SIF-CHI (キトサン添加剤を含むシリコーンフォーム) および SIF-TAN (タンニン酸添加剤を含むシリコーンフォーム) に見られます。また、両方の PUR ベースのフォームは、他の SIF (活性炭添加剤を含む SIF-AC を除く) と比較して、増殖培地中の大腸菌濃度が高くなります。 SIF-MeC - メチルセルロース添加剤を含むシリコーンフォーム、SIF-SHU - シュンガイト添加剤を含む、PUR-EG/APP - 剥離黒鉛およびポリリン酸アンモニウム添加剤を含むポリウレタンフォーム。この図で使用されている略語と、調製されたフォームの特性を表 1 にまとめます。

結果は、増殖培地中の大腸菌濃度 (c[CFU]) が、活性炭添加物を添加した SIF (SIF-AC) 付近で最も高かったことを示しています。元の（無添加）SIFと比較して、SIF-ACの周囲の増殖培地中の大腸菌濃度（CFU/ml）は3倍高くなっています。 c[CFU] のこの有意な差は、親水性活性炭添加剤がフォームキューブの周囲の増殖培地の濃度を増加させることを示唆しています。活性炭は、ファンデルワールス力によって液体の分子を結合する吸着剤として説明されており、バルク流体よりも界面での吸着物の濃度が高くなります33。したがって、SIF-AC 周囲の増殖培地中の c[CFU] に対する影響は、発泡体の細孔表面への細菌の付着の増加に起因する可能性があり、これは SEM (走査型電子顕微鏡) 画像でも見られます (細菌集団形成のセクション)。メチルセルロースの親水性および水溶性の性質により、メチルセルロースがポリマー複合材料から拡散してLBに溶解する可能性がありますが、SIFマトリックス（SIF-MeC）にメチルセルロースを含めても、培地中の細菌増殖の阻害に顕著な効果はありません。原始的なSIF。泡のない増殖培地では、SIF 泡サンプルよりも 1/3 log 低い c[CFU] が得られました。これは、SIF 泡キューブの存在により、25 °C で 24 時間で大腸菌 /LB 濃度が増加することを示唆しています。

シュンガイト添加物を含む SIF-SHU 周囲の接種懸濁液では、元の SIF よりも c[CFU]-s が低くなりましたが、標準偏差の範囲が重複していることに注意することが重要です。したがって、その違いは重要ではない可能性があります。シュンガイトは水性媒体中で抗菌特性があると報告されているため、c[CFU]25 に対する効果が期待されました。 25 °C で大腸菌の増殖を著しく阻害する SIF は、SIF-CHI および SIF-TAN です。元の SIF と比較して、SIF-CHI に含まれる親水性キトサン添加剤は、培地中の細菌の増殖を阻害する際に顕著な効果があるようです。キトサンは水不溶性であるため、ポリマーからの溶解は期待できません。表面からのある程度の突出、またはフォームの切断面からの利用が可能です。 Qin らによる以前の研究によれば、水不溶性キトサンは、水が酸性媒体として作用するため、大腸菌に対して阻害効果を示します 34。 SIF-TAN では、接種期間中に増殖培地の変色が視覚的に検出され、培地へのタンニン酸 (TA) の漏洩が示されます。サンプルを切断し、TA を溶液にさらすことにより、漏れがさらに促進されます。 TA は可溶性の高い分子物質であるため、疎水性架橋ポリマーネットワークからの分子の振動拡散と水性媒体への溶解が可能です 35。 SIF-TAN フォームサンプルは、このテストで他の添加剤をドープしたフォームの中で最も優れた抗菌効果をもたらし、元の SIF よりも c[CFU] が 0.5 log 低くなりました。

一般に、疎水性表面への細胞接着は、McVerry et al. によって以前に記載されています。これは、PDMS の非極性の性質と、その表面が親水性に修飾されると抗菌効果が大幅に増加するためです17。 PUR の表面は本来疎水性 36 ですが、シリコーンほど疎水性ではないため、材料の表面を付着および増殖に使用する可能性がある場合、周囲の媒体での細菌の付着および増殖が予想されます。接触角測定(補足データS1を参照)は、SIFとPURの両方が疎水性(Θ>90°)であるにもかかわらず、水滴がSIFおよびSIF-AC表面よりも効率的にPURおよびPUR-EG/APP表面を濡らすことを示しています。フォームの多孔質の性質により、時間の経過とともに濡れが増加することが観察されました。

SIF と PUR の c[CFU] には 0.5 log の違いがありますが、フォームの構造も考慮する必要があります。同様の泡密度に近い SEM 顕微鏡写真では、PUR 内の比較的大きな空隙が明らかになりました。これは、細菌が付着する表面積が少なく、したがって増殖できることを示唆しています。また、振盪時の培地の激しい動きにより細菌の付着が妨げられる場合があります。フォーム構造を比較した対応する画像は、この原稿のオンライン付録 S1 にあります。

大腸菌/LB に 25 °C (180 rpm) で 24 時間接種したサンプルを 1 × PBS で 5 回連続して洗浄し、細孔からの細菌細胞 (浮遊細胞) の接着・剥離挙動を評価しました。および細孔壁（接着細胞）。以下の図 2A、B の結果は、さまざまな材料が細菌の付着と増殖にどのような影響を与えるか、また抗菌添加剤がフォーム内で何らかの効果を発揮するかどうかを示しています。最初の洗浄 (洗浄 I) から、cI[CFU] 浸出は c24h[CFU] と相関関係があり、ポリウレタンでは最も高く、SIF-TAN/SIF-CHI では最も低くなります。洗浄媒体の c[CFU] を比較すると、1 回目の洗浄で細菌の比較的大部分が浸出することがわかり、その大部分が浮遊性、たとえば泡の中に浮遊していることがわかります。 5回の洗浄以内にすべての細胞が放出されるわけではないため、フォームから洗い流されたバクテリアの合計から材料内のバクテリア全体を知ることはできません。それでも、その後の洗浄 (洗浄 II ～ V) では、周囲の培地よりも合計でより多くの細菌が存在することが明らかになります。

洗浄サイクルによる立方体からの細菌の抽出: 連続洗浄培地中の大腸菌濃度 (CFU/ml PBS)。シリコーンベースのフォーム (A) は、細孔構造の違いによりポリウレタンフォーム (B) から分離されます。後者は非常に大きな空隙を持ち、媒体の交換が促進されます。

図 2 の冒頭の急勾配は、ばらばらの (浮遊性) 生細胞の抽出を示しています。曲線の終わり（洗浄 III、IV、および V）の浅いプラトーは、毛穴からの接着細胞のゆっくりとした剥離を示している可能性があることを示唆しています（図 2A）。洗浄 I ～ III の最も急な曲線は、PUR および PUR-EG/APP の高度に多孔質な構造をよく示しており、懸濁液の通過が速くなります。 PUR とは対照的に、SIF から細菌を抽出するのはより困難です。考えられるメカニズムとしては、疎水性の高い表面への付着の可能性が高いこと、および孔径が小さいため洗浄時の液体交換速度が低下することが挙げられます。 SIF-TAN は 24 時間のインキュベーション後に周囲の増殖培地中の大腸菌濃度が最も低かったため、初期に存在する細菌の数が少なく、溶液への TA の漏出による抗菌効果により、初期のプラトー曲線が期待されます。

また、フォームキューブ内で重大な細菌の増殖があったのか、それとも洗浄の結果が単なる接着の影響なのかにも興味がありました。 1 つの可能性は、大腸菌の付着/接着が接種期間によって影響を受けるかどうかを比較することでした。短期（0 時間、即時洗い流し）接種と長期（24 時間）接種との違いを分析し、その概要を図 3A に示します。

(A) さまざまな接種期間での未使用の SIF フォームからの細菌の放出: 24 時間接種したフォームと接種ステップの直後に洗浄したフォーム (抗菌添加剤なし)。 (B) この実験は、異なる生育条件から生じる濃度の違いを示しています。「AIR」で行われる実験では、余分なブロスや追加のエアレーションや振盪は行われません。 24 時間後、接種された標準 SIF の大腸菌濃度 (CFU/ml) を分析しました。

前と同様に、曲線が急勾配であるため、より多くの細菌が遊離し (浮遊性)、付着が少ないと推測できます。予想通り、より長い期間によりバクテリアが増殖するだけでなく、発泡材料の表面と相互作用することも可能になりました。 24 時間のインキュベーション期間後の洗浄曲線は、すぐに洗い流された細菌よりも細孔からの除去が遅いことを示しています。このようなプラトー状態は、疎水性材料からの段階的な剥離挙動を示している可能性があります。

低湿度条件および栄養素の欠乏における増殖効果を説明するために、培養液を追加したり振盪したりすることなく、25 °C の閉鎖環境でテストを実施し、その後 5 回洗浄しました (AIR テスト、図 3B)。この研究で以前に使用された、フラスコと過剰な LB 培地でのインキュベーションである方法と比較して、泡状サンプルから細菌を除去すると、ウォッシュアウト濃度の曲線はいくぶん似たものになります。これは、細菌が増殖するのに十分な時間があれば、増加すると、材料の表面に付着するのに十分な時間がかかります。

この研究で使用されたすべてのシリコーンフォームは、連続気泡エラストマーポリシロキサンベースのフォームです。フォームは、プレポリマーに分散された非抗菌性の一般的な充填剤を使用して調製されました。このようなフィラー粒子は、元の SIF のポリマー層の下に見えます (図 4A を参照)。抗菌添加剤を含む表面は、中央の画像 (図 4B、SIF-MeC) に見られるように、表面粗さと粒子分布によって視覚的に元の SIF とわずかに異なります。 SIF組成物に使用される一般的なフィラーは標準的なPURおよびPUR-EG/APPには使用されませんでしたが、この組成物に使用されたEGまたはAPP粒子は表面から突き出ているのは目に見えて検出されませんでした（図4C）。

特定の抗菌添加剤を含まない SIF の場合、フォーム壁内の区別できる一般的なフィラー粒子は、表面張力の増加により薄いポリマー層で覆われます (画像 A)。 SIF-MeC の場合、添加剤により表面粗さが増加しますが、ポリマー層の下にまだ残ります (画像 B)。 PUR-EG/APP の滑らかな表面と中空構造により、接着面が少なくなります (画像 C)。

抗菌目的の添加剤は、プレミックスの比較的大部分を占め、その範囲は 0.3 ～ 5.0 wt% です。細孔壁の厚さと比較した粒子の空間寸法により、発泡プロセス中に粒子が表面/突出して、その結果として壁が薄くなることが可能になるはずです。したがって、添加剤が細胞膜を妨害して細胞溶解や細胞死を引き起こす可能性がある場合、細菌と部分的または直接接触すると、細菌の増殖に影響を与えると考えられます15。

ただし、合成条件と結果として得られるフォームパラメータ (壁の厚さ、添加剤の含有量、粒子の寸法、しかし最も重要なのは表面張力) が原因で、これらの粒子が完全には表面に現れず、大部分が薄いポリマー層で覆われたままになる可能性があります。。この現象を確認するために、20 の異なる領域に焦点を当てて SIF 表面の EDX 分析を実行し、表面の元素組成を取得しました。元素（Si、C）の分布は、SEM-EDX 技術によって得られた元素マップに示されています（図 5）。

SIF-SHU フォームの骨格断面と細孔表面の SEM-EDX 分析元素マップは均一な Si 分布を示し、シリコーンがフィラー粒子の表面に存在することを示しています。断面の元素マップからは、SEM 画像で見られるフィラー粒子と一致する特定の炭素密度の高い領域が明らかになります。 Si 元素マップは、シリコーンがフィラー粒子上にある程度存在することを示しています。ＳＩＦ－ＣＨＩの場合、元素組成は次の通りである：Ｃ６１．２、Ｏ６．３、Ｓｉ３２．５重量％、およびＣ７６．７、Ｏ５．９、Ｓｉ１７．４原子％。ＳＩＦ－ＳＨＵの場合、元素組成は、Ｃ４８．９、Ｏ２８．８、Ｓｉ２２．３重量％、およびＣ６１．０、Ｏ２７．０、Ｓｉ１１．９原子％であった。

組成イメージングの結果は、粒子がシリコーンプレポリマーによく組み込まれ、添加剤の表面に絡み合ったポリマー鎖を残していることを示唆しています。たとえば、EDX スペクトルを取得することで、ポリマーマトリックス内の炭素密度の高いシュンガイト領域が表示されます。原子パーセントと重量パーセントで測定された SIF の表面値の EDX スペクトルの詳細は、図 5 の画像の下にリストされています。使用された添加剤の元素組成は主に C と H ですが、SIF-CHI の SEM-EDX 結果では、細孔表面の窒素濃度が低い。

観察されたすべてのサンプルの中で、24 時間のインキュベーション期間後 (ウォッシュアウトなし)、細菌は SIF の表面上の異なる構造形成に位置する傾向があります。付着した大腸菌の均一な分布は、未使用の SIF および SIF-AC でのみ観察されます (図 6)。これは、シリコーンの疎水性表面特性によって細菌の付着を妨げる影響が少ない、またはまったくないことを示唆しています。細菌はまた、フィラーが存在する部位にも付着しましたが、その上または周囲で目に見える目立った行動は見られませんでした (図 6、中央上部の画像)。

SIF (画像 A ～ D) および SIF-AC (E、F) の表面上の大腸菌の均一な分布。複数の大腸菌がポリマーの上に存在し、その下でポリマーがフィラー粒子を覆っています (画像 B、C)。線毛の形成は、元の SIF 上で見ることができます (画像 D)。活性炭を含む SIF の場合、細菌は凝集領域を形成しますが、これは標準的な SIF 表面とは明らかに異なる形成です。

表面積が大きい活性炭は親水性があり（表面積が大きいほど親水性が高くなります）、吸着能力が高いと考えられます33。 AC添加剤を含むすべてのフォームの細孔表面に細菌が均一に広がり、単一部位にいくつかのより大きなコロニー/凝集体が存在することがわかりました。線毛の形成は主に抱合時の付着に関与し、固体表面への結合を可能にし、グラム陰性菌が遺伝情報を共有して増殖するのに適した条件の証拠である（図6、中央下）。これらの広がった形成では線毛はまれですが、コロニークラスターの形成ではより可能性が高くなります。

SIF および SIF-AC での同様の形成に加えて、水不溶性添加剤 (シュンガイト、キトサン) および水溶性添加剤 (タンニン酸、メチルセルロース) のグループにおける独特の挙動に気づきました。シュンガイトはさまざまな修飾をした炭素を持ち、不溶性ですが、抗菌特性をもたらすいくつかの溶解成分に寄与しています 25,37。 SEM分析により、細菌はSIF-SHUサンプルの最も外側の細孔でのみ検出され、内側の細孔には細菌がほとんど存在しないことが明らかになりました（図7）。このような成分が骨格から漏れ出れば、フォーム内に細菌が付着していないことが説明されます。最初、接種懸濁液中の溶解粒子の濃度は、大腸菌の濃度が比較的高い立方体の周囲で低くなります（接種懸濁液の総量は 30.5 ml、そのうち立方体内の < 2.7 ml）。

シュンガイトの成分が溶解するため、細菌は SIF-SHU サンプルの最も外側の細孔でのみ見つかります (画像 B、C)。最も外側の細孔には、いくつかの凝集した細菌の形成が見られます。画像 (A) と (B) は同じサンプルの異なる領域の複製であり、画像 (C) は画像 (B) の拡大です。

不溶性キトサン添加剤 (SIF-CHI) を含むサンプルでは、付着した大腸菌が不均一に分布しています (図 8)。一部の細孔では少数の微生物しか見つかりませんでしたが、サンプルの側面に近い細孔には不均一に生息していました。ここでも、一部の細菌は大きなクラスター/凝集体として存在していましたが (図 8、画像 A)、これは超臨界抽出前は浮遊形態であった可能性があります。元のSIF (図6) およびSIF-AC (図6) で見られたような分布は見つかりませんでした。

キトサンをドープしたフォーム (SIF-CHI) は、細孔の表面に大腸菌が不均一に分布していることを示しました。画像 (A ～ C) では、一部のエリアには時折人が住んでいますが、一部には特定の地層がなくきれいなエリアもあります。画像 (A ～ C) は、同じ観察サンプルの複製です。

この研究では、材料表面のメチルセルロース（SIF-MeC）の抗菌効果がキトサン（SIF-CHI）と同様であることを発見しました（図9B、C）が、その抗菌効果は材料表面では無視できるほどです。増殖培地 (図 1)。後者は、メチルセルロースとキトサンがシリコーンフォームの細孔内の細菌の付着に影響を与えることを示しています。

親水性添加剤を含む SIF の表面上でのさまざまな構造の形成: SIF-AC では層状構造としての細菌 (A)、SIF-MeC では表面の粗さが目に見えて増加し、時折付着した細菌が分布している (B)、および単一の大きな c クラスターSIF-CHIの毛穴内の細菌（C）。

興味深いことに、タンニン酸 (TA) 添加剤を含むフォームの細孔表面には、上記のような細菌の付着は見られませんでした。激しい通気（１８０ｒｐｍ）を伴うインキュベーション期間中に、高可溶性ＴＡ（溶解度：２８５０ｇ／Ｌ水、１．７ｍｏｌ／Ｌ）が泡から漏れ、懸濁液の黄色から黄褐色への変色から検出可能であった。サンプルは接種前に凍結切断されたため、一部の TA 粒子が緩んで露出している可能性があります。それぞれのSEM画像（SIF-TAN）では、細孔壁に細菌は見つかりませんでした（図10）。 SIF-TAN では細孔が相互につながっており、大腸菌のサイズ (2 ～ 5 μm) を考慮すると、細菌は液体培地とともにフォームキューブの空隙全体に自由に浮遊することができました。目に見える表面コロニー形成がないため、洗浄中に漏れた細菌が接種懸濁液中で浮遊し、増殖していた（例えば、浮遊状態にある）と考えられます。同様の条件下での微生物の浮遊性ライフスタイルも Tan らによって示唆されています 38。

0.5 wt% TA 添加剤を含む SIF の細孔表面には細菌が存在しません。画像 (B) および (C) では大腸菌は存在しませんが、細孔表面にフィラー粒子の残留物が見られます。画像 (A) および (B) はサンプルの異なる領域の複製であり、画像 (C) は画像 (B) の拡大図です。

SIFと比較して、分析された低密度PUR（PURおよびPUR-EG）は付着する表面積が大幅に小さく、構造はより中空になっています（図11、上段）。興味深いことに、発泡および硬化のプロセス中に、PU 素材からの糸状の橋が細孔の端を横切って形成され、そこにほとんどの大腸菌が付着します。接種/増殖培地がチャネルを流れると、浮遊細菌がこれらの部位に付着し、より大きなコロニーが形成されます。 SIF ではそのような活動の証拠は見つかりませんでした。 EG (剥離黒鉛) と APP (ポリリン酸アンモニウム) を含む難燃性ポリウレタンフォームである PUR-EG フォームの場合、ほとんど/すべての細菌が大きなコロニーを形成し、細胞材料の表面にはほとんど存在しないことに気づきました (図 11、下)行）。これらの地層は互いに隣接しています。 PUR に関しても、配線孔の材料ブリッジに大腸菌が付着しています。

ポリウレタンフォーム (PUR、画像 A ～ C、および PUR-EG/APP、画像 D ～ F) は、特徴的な中空構造を持っています。細菌の大部分は、細孔の空隙を横切って糸状の構造に付着しています (画像 A、B、F)。一般に、PUR では、SIF では蔓延していない大腸菌の複数の大きな細菌形成が見つかります。

テストで使用したフォームサンプルは、射出成形プロセスによって調製されました。選択した添加剤をシリコーン組成物に導入して、平らな非多孔質表面とは対照的に、フォーム内の細菌の増殖に対する添加剤の影響を評価しました。

SIF 合成では、ビニル末端およびヒドロキシル末端ポリ（ジメチルシロキサン）（5000 cSt）、100% 水素官能化ポリ（メチルヒドロ）シロキサン（25 ～ 35 cSt）、および Karstedt 触媒（白金（０）−１，３−ジビニル−１，１，３，３−テトラメチルジシロキサン、湖北化学から入手した０．０５％Ｐｔ）、およびＭｉｌｌｉＱグレードの水。減速材 SIT7900.0 (1,3,5,7-テトラビニル-1,3,5,7-テトラメチルシクロテトラシロキサン) および一般強化充填剤 HMDZ 処理ヒュームドシリカ SIS6962.0 (LOT# 11698972251) は Gerest Inc から入手し、白雲母雲母ノルウェーのOMYA産（Virk OÜから供給、受け取ったまま使用）。

得られた連続気泡フォームの密度は 80 ～ 175 kg/m3 の範囲で、1.3 × 1.4 × 1.5 cm3 (体積 2.7 cm3) の長方形片に切断されました。発泡体の気孔率は、シリコーン複合材料のかさ密度が１ｇ／ｃｍ３であることを考慮して、発泡体密度から計算した。参考として、エステラックス OÜ の工業生産から得られた 2 つのポリウレタンフォームを同じ方法で比較しました。テストフォームのリストは表 1 にあり、有機添加剤分子の構造情報は図 12 に示されています。

キトサン (A)、メチルセルロース (B)、タンニン酸 (C) の分子構造。

試験微生物である大腸菌（E. coli）ニッスル株をすべての実験で使用した。 Luria-Bertani 栄養ブロス (LB) および 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (1XPBS) は、タルトゥ大学工科大学によって調製されました。細胞固定用のホルムアルデヒド溶液 (37%) は Panreac AppliChem から入手しました。 Estelaxe OÜ は PU ベースのフォームサンプルを提供し、ポリシロキサンベースのサンプルは社内で合成されました。

プレポリマー混合物は、PTFE で覆われた回転ブレードを備えたスタンドアロンミキサーを使用して調製されました。プレミックスの成分は 2 つの異なる部分に分離され、1 つは触媒と減速剤を収容し、もう 1 つは他の官能化プレポリマーに加えて水素化物を含有します。両方の成分を別々に混合し、実験室で設計された射出成形装置によって混合および射出して、フォームサンプルごとに総量 500 ml の事前混合物を分配しました。

大腸菌培養液のループをガラスバイアル内の標準的な LB ブロスに移し、火炎滅菌した金属キャップで密封しました。調製した大腸菌細胞懸濁液を、180 rpmの振とう速度で37℃で20時間インキュベートしました。

接種前に、泡状サンプルの滅菌を真空オーブン (Memmert) で 200 °C、3 mbar で 60 分間、空気感染を避けるためにアルミホイルのキャップで密閉した三角フラスコ内で実行しました。泡サンプルに接種するために、30 mL の滅菌 LB 培地と 0.5 mL の大腸菌前培養液の混合物を調製しました。増殖培地の初期濃度は約 (0.5…1) × 108 CFU/ml で、希釈液をプレーティングし、コロニーを 3 回計数することによって決定されました。この研究で使用されたシリコーンフォームは、密度が低く (85 ～ 175 kg/m3)、細孔が小さく (直径 < 1 mm)、本質的に疎水性が高かった。したがって、細菌が開いた構造を通って流れるように、調製した大腸菌/LB 混合物にフォームサンプルを浸して絞ることによってフォームサンプルを脱気する必要がありました。空気中の細菌を殺すために、炎の近くで滅菌した金属ピンセットを使って絞りました。サンプルと大腸菌/LB 懸濁液を含むフラスコを 25 °C、180 rpm で 24 時間振盪しました。

まず、泡立方体の周囲の 24 時間増殖培地からアリコートを収集しました。さらに、泡サンプルから細菌を抽出するために一連の洗浄が行われました。各泡立方体を、30 ml の 1 × PBS (リン酸緩衝食塩水) を含む滅菌三角フラスコに移し、続いて 25 °C、180 rpm で 10 分間の洗浄サイクルを行いました。さらなる分析のために、各洗浄からのサンプル (PBS および抽出された細菌) がサンプリングされました。このステップを５回の洗浄が行われるまで繰り返した。

最初の 24 時間増殖培地とその後の洗浄培地をすべて分析して、細菌濃度を測定しました。ＯＤ６００をＵＶ／ＶＩＳ分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ７０００、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）によって評価して、洗浄サンプルの細胞密度を評価した。サンプルは、1 × PBS を使用して各ステップで 10 倍に連続希釈されました。 100 μL の希釈液を LB 寒天プレート上にプレーティングし、37 °C で一晩インキュベートしました。細菌コロニーを数え、特定の希釈係数を考慮して初期濃度を計算しました。抗菌活性/抗菌効果は、泡なし接種材料の細菌濃度を考慮した細菌の減少率によって確認できます。

それぞれの特定の組成物について、24 時間後に一組の泡立方体を接種懸濁液から取り出した。細胞固定のために立方体を 1 × PBS 溶液中の 3.7% ホルムアルデヒドに浸し、さらなる分析のために +4 °C に保ちました。発泡体の細孔内のＦＡ／ＰＢＳ溶液のエタノール（９９．５％）への段階的交換、例えば連続脱水が行われた。泡サンプルを、40、50、60、70、80、90、および 96 vol% のエタノールの各溶液に最低 2 時間保持しました。さらに、99.5 vol% エタノール中で一晩放置し、さらに 99.5 vol% を保存します。

イメージング用の細胞を準備するために必要なステップである超臨界 CO2 抽出プロセスは、臨界点乾燥機 (E3100、Quorum Technologies) とサーモスタット (Proline RP 1845、LAUDA) を使用して実行されました。 SEM (Hitachi TM3000、15 kV) で断面を画像化するために、サンプルをメスを使用して凍結切断し、7.5 nm の金層でスパッタコーティングしました。

SEM-EDX 技術を適用して元素分布をマッピングし、発泡材料の表面組成を取得しました。 EDX には、SwiftED3000 (Oxford Instruments) を SEM (Hitachi TM3000) と組み合わせて利用しました。元素組成は20点のデータを収集し、その結果を平均して分析しました。

発泡材料の親水性は、水滴とポリマー発泡体の表面および成形時に形成される皮膚状層との間に形成される接触角を測定することによって評価した。この目的のために、3 つの異なる領域に水滴が付けられました。結果は、異なるポリマーフィルム部品に対する 3 回の測定の平均値です。結果は補足 S1 にまとめられています。

マットレスやシートクッションで最も一般的な病原菌の 1 つであるグラム陰性大腸菌をフォームに接種することによって、ポリウレタンフォームと比較したさまざまなシリコーンフォームの抗菌活性を評価しました。通常、微生物を伴うさまざまな流体は、その用途を特徴づける繰り返し圧縮中に材料の細孔に侵入する傾向があります。したがって、我々が適用した定量的方法は、過剰な運搬媒体が利用可能であり、浮遊細菌が表面に自由に付着できる条件下での弾性三次元構造における細菌の増殖を記述するのに適している。

最終製品を浸漬または浸漬コーティングするのはやや面倒であるため、我々は、ポリマーマトリックスに組み込まれた市販の低コストの天然添加剤の抗菌活性を比較することに焦点を当てました。この研究の結果から次の結論が導き出されます。

大腸菌の外膜の大部分は親水性ですが、部分的な疎水性と SIF 表面の微細粗さの組み合わせは細菌の付着を可能にするのに十分です。

抗菌効果、または抗菌効果の欠如は、抗菌部位として機能すると予想される添加剤粒子を覆う薄いポリマー層によって説明できる可能性があります。

添加剤粒子は薄いシリコーン層で覆われていますが、プレポリマーに組み込まれた非水溶性の親水性添加剤は、表面粗さが増大することによりフォーム表面への大腸菌の付着に影響を与えます。

タンニン酸などの水溶性添加剤は、ポリマーマトリックスから溶解するとかなりの抗菌効果を示します。

24 時間の潜伏期間中、グラム陰性菌である大腸菌は、ポリウレタンベースのフォームよりもポリシロキサンベースのエラストマー表面に付着する傾向が高くなります。ただし、未使用のポリシロキサンの周囲媒体中の細菌濃度は、標準的なポリウレタンよりも低くなります。

我々は、低コストの天然添加剤を浸漬コーティングせずにポリマーマトリックスに最初に組み込むことで使用することで、シリコーンフォームの表面での微生物バイオフィルムの形成を回避できると結論付けています。将来の研究では、エラストマーの機械的特性が所望の用途に許容できる範囲内でのフィラー含有量の変動を分析することが不可欠です。

この記事の結論を裏付けるデータセットは、記事とその補足ファイルに含まれています。現在の研究中に使用および/または分析された追加の SEM 画像は、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、2019 年 5 月 8 日から 2022 年 5 月 7 日まで、SA Archimedes (助成金番号 2014-2020.4.02.19-0155) によって支援された開発プロジェクトの一部を形成しました。方法論の選択における貴重な洞察を提供してくれた Marje Kasari に感謝します。

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イングリッド・レバネ、ハンス・プリクス、カール・ヤコブ・レビン、イスマイル・サリギュル、ウルマス・ヨハンソン、タネル・テンソン、タルモ・タム

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ウノ・メーオルグ

Estelaxe OÜ、パークセパ、エストニア

ピーテル・ピリマジ

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IR は調査と結果の正式な分析、および原稿の執筆を担当しました。 IR と KJL がサンプルを準備し、TT、HP、IS、IR が方法論の開発を担当し、TT、TT、HP、UM、UJ が研究作業の概念化と監督を行い、TT と PP がリソースを提供しました。著者全員が原稿をレビューしました。

イングリッド・レバネへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

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受信日: 2023 年 1 月 30 日

受理日: 2023 年 5 月 15 日

公開日: 2023 年 5 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35239-9

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